V tomto příkladu bude gen z knihovny savčích genů subklonován do bakteriálního plazmidu (cílová platforma). Bakteriální plazmid je část kruhu DNA, která obsahuje regulační prvky umožňující bakteriím produkovat genový produkt (genová exprese), pokud je umístěn na správném místě v plazmidu. Výrobní místo je ohraničeno dvěma restrikčními místy pro enzymové řezání "A" a "B" s nekompatibilními lepivými konci.
Savci DNA nepřicházejí s těmito omezovacími místy, takže jsou zabudováni přesahem překryvu PCR. Primery jsou navrženy tak, aby umístily restrikční místa pečlivě, takže kódování proteinu je v rámci a na každou stranu proteinu je implantováno minimum dalších aminokyselin.
Jak PCR přípravek obsahující savčí gen s novými omezení míst a cílové plasmidu se podrobí omezení trávení a trávení produkty se čistí gel electrophoresis .
Produkty trávení, které nyní obsahují kompatibilní lepivé konce navzájem (ale nekompatibilní lepivé konce samy o sobě), se podrobí ligaci, čímž se vytvoří nový plazmid, který obsahuje prvky pozadí původního plazmidu s odlišným inzertem.
Plazmid je transformován na bakterie a identita inzertu je potvrzena sekvenováním DNA .
Obrázek 274A | Tento obrázek ukazuje postup subcloning, jak je nastíněno vlevo. | Původním uploaderem byl Takometer na anglické Wikipedii. / Attribution 2.5 Generic | Page URL : (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Subcloning.png) from Wikimedia Commons
Autor : Yavor Mendel
Komentáře
Okomentovat